動態(tài)高速濕轉(zhuǎn)儀是Western Blot實驗中實現(xiàn)蛋白質(zhì)從凝膠高效轉(zhuǎn)印到膜上的關鍵設備，其操作流程直接影響實驗結(jié)果的準確性和重復性。以下為標準化操作步驟：
一、設備安裝與調(diào)試
設備檢查
確認儀器外觀無損壞，電源線、轉(zhuǎn)膜夾、海綿墊、濾紙等配件齊全。
檢查轉(zhuǎn)膜槽密封性，確保無漏液風險。
安裝位置
將儀器放置于平穩(wěn)操作臺，遠離熱源和振動源。
確保通風良好，避免設備過熱。
電氣連接
連接電源線，檢查電壓是否符合設備要求(通常為220V)。
開啟電源，觀察儀器自檢是否正常。
參數(shù)預設
根據(jù)實驗需求設置轉(zhuǎn)膜參數(shù)(如電壓、電流、時間)。
推薦參數(shù)：
電壓：100-250V(根據(jù)凝膠厚度調(diào)整)
時間：10-15分鐘(動態(tài)高速濕轉(zhuǎn)儀可縮短至傳統(tǒng)時間的1/5)
溫度：4℃(需預冷轉(zhuǎn)膜液)
二、實驗前準備
凝膠制備
完成SDS-PAGE電泳，取出凝膠并切除濃縮膠。
將分離膠浸入轉(zhuǎn)膜液中平衡5-10分鐘。
膜處理
根據(jù)實驗需求選擇PVDF膜或NC膜。
PVDF膜需用甲醇激活15秒，再浸入轉(zhuǎn)膜液中平衡。
濾紙與海綿準備
裁剪與凝膠大小匹配的濾紙(6.5×10cm)和海綿墊。
將濾紙和海綿浸入轉(zhuǎn)膜液中充分潤濕。
三、轉(zhuǎn)膜操作
組裝“三明治”結(jié)構(gòu)
陰極(黑色面)：海綿墊 → 濾紙 → 凝膠 → 膜 → 濾紙 → 海綿墊
陽極(紅色面)：覆蓋后閉合轉(zhuǎn)膜夾，確保無氣泡。
安裝轉(zhuǎn)膜夾
將轉(zhuǎn)膜夾插入轉(zhuǎn)膜槽，黑色面對黑色電極，紅色面對紅色電極。
加入預冷轉(zhuǎn)膜液至標記線，避免液面過高導致短路。
啟動轉(zhuǎn)膜
蓋上轉(zhuǎn)膜槽蓋子，連接冰盒或循環(huán)水冷裝置。
按下啟動按鈕，開始轉(zhuǎn)膜。
四、實驗優(yōu)化與注意事項
溫度控制
轉(zhuǎn)膜過程中持續(xù)冰浴，防止溫度過高導致蛋白質(zhì)降解。
動態(tài)高速濕轉(zhuǎn)儀通過內(nèi)置冷卻系統(tǒng)或外接冰盒維持低溫。
氣泡排除
用玻璃棒或滾輪輕輕趕走凝膠與膜之間的氣泡。
氣泡會導致轉(zhuǎn)膜不均勻，影響結(jié)果。
參數(shù)調(diào)整
凝膠厚度：0.75mm凝膠用100V，1.5mm凝膠用150V。
轉(zhuǎn)膜時間：根據(jù)目標蛋白分子量調(diào)整(如小分子蛋白可縮短至7分鐘)。
電流監(jiān)測
動態(tài)高速濕轉(zhuǎn)儀通過實時電流反饋優(yōu)化轉(zhuǎn)膜效率。
若電流異常(如過高或過低)，需檢查電路或轉(zhuǎn)膜夾連接。
五、轉(zhuǎn)膜后處理
膜的取出
轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，打開轉(zhuǎn)膜夾，將膜浸入麗春紅S染液中染色5分鐘。
根據(jù)條帶清晰度判斷轉(zhuǎn)膜效果。
封閉與孵育
將膜浸入5%脫脂牛奶中封閉2小時。
一抗孵育(4℃過夜)→ 二抗孵育(室溫1小時)。
顯影
使用ECL發(fā)光液顯影，通過化學發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像。
六、設備維護與故障排除
日常維護
每次使用后清潔轉(zhuǎn)膜槽，避免鹽結(jié)晶。
定期檢查電極和密封圈，更換老化部件。
常見故障
漏液：檢查密封圈是否損壞或轉(zhuǎn)膜夾是否閉合緊密。
電流異常：檢查電源線、電極連接及轉(zhuǎn)膜液導電性。
轉(zhuǎn)膜不均：重新檢查“三明治”結(jié)構(gòu)組裝和氣泡排除。
總結(jié)
動態(tài)高速濕轉(zhuǎn)儀通過優(yōu)化轉(zhuǎn)膜參數(shù)和溫度控制，顯著縮短轉(zhuǎn)膜時間并提高效率。嚴格遵循標準化操作流程，結(jié)合實驗優(yōu)化技巧，可確保Western Blot實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和重復性。
